熒光顯微鏡觀察GFP蛋白的方法和注意事項(xiàng)

熒光顯微鏡(Fluorescence microscope) ： 熒光顯微鏡是以紫外線為光源， 用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。 細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。

熒光顯微鏡觀察GFP蛋白使用方法

（1）打開熒光顯微鏡燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱15min才能達(dá)到***亮點(diǎn)。

（2）透射式熒光顯微鏡需在光源與暗視野聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的壓制濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片、雙色束分離器、壓制濾片的插塊。

（3）用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。

（4）放置GFP標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須用無熒光的特殊鏡油；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需待汞燈完全冷卻后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。

（5）觀察。例如：在熒光顯微鏡下用藍(lán)紫光濾光片，觀察到經(jīng)0.01%吖啶橙熒光染料染色的細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。

熒光顯微鏡觀察GFP熒光蛋白

熒光顯微鏡觀察GFP蛋白的操作注意事項(xiàng)

（1）嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。

（2）應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。

（3）防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。

（4）檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，***多不得超過2～3h。

（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。

（6）GFP標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。長時(shí)間的激發(fā)光照射標(biāo)本，會使得熒光衰減和消失現(xiàn)象，故應(yīng)盡可能縮短照射時(shí)間。暫時(shí)不觀察時(shí)可用擋光板遮蓋激發(fā)光。

（7）GFP標(biāo)本觀察時(shí)候應(yīng)采用無熒光油，應(yīng)避免眼睛直視紫外光源。

（8）電源應(yīng)安裝穩(wěn)壓器，電壓不穩(wěn)會降低熒光燈的壽命。

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